「涙」で乳がんがわかる、2年後めどに実用化目指す

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涙の中に含まれるエクソソームを調べることで、乳がんかどうかがわかる──。そんなまったく新しい検査法の開発が進行中だ。エクソソームはさまざまな細胞から放出される100ナノメートル程度の大きさの細胞外小胞の一つ。がん細胞から出るエクソソームは、がんの増殖や転移に関わることが明らかになっており、体の負担が少ないキリッドバイオプシー（液体生検）によるがん診断のバイオマーカーとして大いに注目されている。
神戸大学大学院工学研究科の竹内俊文教授らは、分子インプリンティング技術を用いて、このエクソソームを超高感度に検出する測定法を開発した。超高感度ゆえに、「涙」という微量な検体でも測定が可能。しかも従来の検査法に比べ、簡便かつ迅速にがん細胞由来のエクソソームを識別できるという。今後は臨床試験によるデータを蓄積し、2022年度までの実用化を目指す。涙が乳がん早期発見の立役者になるというユニークな検査法に期待大だ。
　ドライアイの検査で用いるシルマー試験紙を目尻に挟んで、待つこと数分。試験紙に涙が滲んで青色に変わってきたら、涙の採取は終了。あとは自動分析計で涙の中のエクソソームを測定すれば、乳がんかどうかがわかるというのだから、驚きだ。乳がんの検査といえば、乳房を強く圧迫してレントゲン撮影をする乳房マンモグラフィや超音波検査が一般的だが、それに比べるとあっけないほどに簡単で、受ける側の負担はすこぶる軽い。
シルマー試験紙による涙の採取
瞼の縁にシルマー試験紙（濾紙）を挟んでしばらく目を閉じていると、涙が滲みだして試験紙が青色になる。青色の部分が1～数ミリほどになれば、検体として十分だという（写真提供：竹内教授）
　それにしても、乳がんの検査になぜ「涙」なのか。神戸大学大学院工学研究科の竹内俊文教授は次のように語る。
　「エクソソームは体液中に存在するので、もちろん血液や唾液などから検出することもできる。ただ血液中には食事から摂取した栄養素など様々な物質が溶け込んでいるし、唾液ともなれば食べかすや細菌なども多い。その点、涙にはそういった夾雑物（きょうざつぶつ）が少なく、生体試料として非常に魅力的。涙液中のエクソソームは血液中に比べると10の1から100分の1程度と少ないが、私たちが開発した超高感度の分析計を使えば、十分に測定できる」
　涙が魅力的な点は他にもある。前述したように、検体採取が非常に容易なことだ。被験者自身が簡単に短時間で採取できるし、マンモグラフィのような痛みも伴わない。わざわざ病院に足を運ばなくても、自宅や近所のドラッグストアなどで自己採取をして検査機関に送るといった方法も将来的には可能だろう。多くの女性が手軽に検査を受けられるようになれば、早期に発見できる乳がんがもっと多くなる。
低迷する乳がん検診受診率への問題意識
　乳がんは、女性がかかるがんで最も多い。患者数は増加の一途で、2017年の最新がん統計によると、生涯で乳がんに罹患する確率は10.6％。実に女性の9人に1人に相当する。罹患者数は40代と60代にピークがあり、働き盛りの女性や子育て中の女性にとって大きな脅威となっている。
　「乳がんは早く見つけて治療をすれば治る病気だが、それにもかかわらず死亡者数も年々増加している。乳がんで亡くなった有名人などのニュースを見るにつけ、どうして治るはずの病気で……と非常に残念な気持ちになった。命を落とさないためには早期発見しかないが、乳がん検診の受診率は4割程度で低迷しているのが現状。ならば、もっと簡単に気軽に受けられ、しかも精度の高い新しい検査法を創れないものか。そんな思いが研究開発の動機になった」と竹内教授は話す。
　そこで2016年から取り組み始めたのが、涙液中のエクソソームを測定することで乳がんを検出する「TearExo（ティアエクソ）法」の開発だ。神戸大学医学部附属病院放射線腫瘍科の佐々木良平教授、乳腺内分泌外科の谷野裕一教授、測定機器メーカーのシステム・インスツルメンツらとタッグを組み、共同研究を行う研究集団「チームTearExo」を立ち上げた。言うまでもなく、「Exo」はエクソソームを表している。
　エクソソームは、体の中のあらゆる細胞から放出される脂質二重膜を有する100ナノメートルほどの小胞。現在、感染拡大が続く新型コロナウイルスとちょうど同じくらいの大きさだ。内部にはそれを放出した細胞に由来するマイクロRNAやメッセンジャーRNAなどの核酸物質が含まれ、膜表面にもそれを放出した細胞の細胞膜に由来する物質が存在する。つまり、エクソソームには放出元の細胞の特徴が反映されているわけだ。
　「がん細胞由来のエクソソームが検出されれば、体内にがんが存在するということ。エクソソームはがんの新しいバイオマーカーとして有望視され、エクソソームを用いた体の負担が少ないリキッドバイオプシー（液体生検）の開発が現在、盛んに行われている。その多くは血液中のエクソソームを回収して破砕し、その中のマイクロRNAを測定する方法だが、我々はエクソソームの表面にある膜たんぱく質（表面抗原）をターゲットにし、エクソソームを破砕せず、インタクトの状態で測定している」（竹内教授）
エクソソームの構造と役割
細胞から放出されるエクソソームには、その細胞と同じ核酸物質（マイクロRNAやメッセンジャーRNA、DNAなど）やたんぱく質が含まれている。エクソソームは体液に乗って体内を移動し、放出元細胞の情報を他の細胞に伝える。細胞間の情報伝達という役割を担っているわけだ。がんの増殖や転移にも関
ナノ加工技術を用いて独自のセンシングチップを開発
　では、どうやってエクソソームを検出するのか。竹内教授らは独自のセンシングチップを開発しているが、その仕組みが実にユニークだ。チップ表面にナノメートルサイズの穴をたくさん開けて、そこにエクソソームを誘導して捕捉するのだという。
　「センシングチップ上に開けた穴は、エクソソームとほぼ同じ大きさ。そして穴の中にはエクソソームの表面抗原と選択的に結合する抗体と、その結合を知らせるための蛍光物質を仕込んでいる。エクソソームが抗体に引き寄せられて穴の中にはまると、蛍光物質の発光量が変化する仕組みだ。この光の変化を蛍光顕微鏡で読み出して、エクソソームを測定する。夜空の星のように光を放っていた穴が、エクソソームが入り込むことで輝きが鈍ってしまう、そんなイメージを想像してもらえればいいだろうか」
　星空の下、精巧な罠を仕掛けて獲物（エクソソーム）を捕らえる。そんな絵本のような光景が浮かんでくる。センシングチップの構造にしては、なかなか文学的だ。
　センシングチップ上に穴を開ける際、活用したのが鋳型重合法の一つである分子インプリンティング技術だという。竹内教授は30年ほど前から、この分野の研究を続けてきた。
　「ある形の物質を混ぜ入れて固め、後でそれを取り除くと、そこにはその物質と同じ形の空間ができる。石膏のギプスや金型を作るのと原理は同じ。それを分子レベルで行うのが、分子インプリンティング技術だ。我々は、エクソソームとほぼ同じ大きさのシリカナノ粒子を利用して、センシングチップ上にエクソソームが結合するナノ空孔を形成。さらに独自の修飾技術を用いて、エクソソーム表面に発現している抗原に対する抗体と蛍光物質を空孔内のみに導入することに成功した」
　ナノ加工技術でエクソソーム結合空孔を作り、抗原抗体反応を利用してエクソソームを回収する方法は、これまでにない画期的な測定法として注目されている。鋳型を作るのに最初はエクソソームそのものを利用していたが、シリカナノ粒子の方が強度に優れているし、コストも抑えられるという。
エクソソームセンシングチップのメカニズム
センシングチップの基板上に約30ナノメートルの厚さのポリマー層を形成し、エクソソームを捕らえる空孔を作る。空孔内には、エクソソーム表面の膜たんぱく（表面抗原）と結合する抗体、及び蛍光分子が仕込まれている。抗体に引き寄せられてエクソソームが空孔内に入ると、蛍光強度が変化する（提供：竹内教授）
ることが報告されている（作図：三弓素青）

従来の検査法に比べ約1000倍の高感度測定が可能に
　実際の検査の流れはこうだ。涙を採取したシルマー試験紙をリン酸緩衝液に浸して、涙液中のエクソソームを抽出する。その検体を、独自に開発したエクソソーム自動分析計でセンシングチップに吸い込み、1分後、センシングチップ表面の蛍光変化を測定する。分析時間は、一チップにつき5分以内。超遠心などの前処理が要らず、短時間で分析できるのが特長だという。
　また精度も高い。「100μL中に約50個程度のエクソソームを検出できる。従来の酵素免疫測定法に比べると、約1000倍の高感度測定が可能になった」と竹内教授は自信をのぞかせる。
エクソソーム自動分析計とセンシングチップを組み込んだ特注の扁平型ピペットチップ
右上の写真赤丸がセンシングチップ。金色に輝くチップの表面上に形成された極少の穴が、エクソソームを待ち構えている。エクソソーム自動分析計は、システム・インスツルメンツと共同で開発。3Dロボットアームを備えた自動分注装置に高感度CMOSカメラ搭載の蛍光顕微鏡ユニットを装着。試料の吸引・吐出・チップの洗浄も自動で行う（ピペットチップの写真：今 紀之、自動分析計の写真提供：竹内教授）
　竹内教授らは、このTearExo法を用いて乳がん患者と健常人の涙液中のエクソソームを比較した。乳がんに関連する抗Her2抗体や抗ER抗体など、エクソソーム表面に発現する5種類の抗原を調べた結果、抗Her2抗体と抗GGT1抗体に対する応答が乳がん患者と健常人で大きく異なり、5種類の抗体に対する結合パターンを主成分分析したところ、乳がん患者と健常人の識別ができた（グラフ）。
乳がん患者と健常人の比較
乳がん患者と健常人（各5人）の涙液中のエクソソームをTearExo法で調べた結果、乳がん患者と健常人がきれいに分離（識別）できた。（データ提供：竹内教授）
　また、乳がん患者が手術で乳がんを摘出した後は、エクソソームも健常人と同様になることも確認できたという。40代のある患者は、手術前に高値だった抗Her2抗体と抗ER抗体が術後には低下し、健常人のレベルに戻った。また検査ではHer2ネガティブとされていたが、TearExo法は感度が高いせいか、ポジティブである可能性が示唆されたという。ポジティブなら分子標的薬のハーセプチンが適応になる。治療の選択肢が広がるわけだ。
　「TearExo法は、乳がん検診だけでなく、治療薬の適応や効果、投薬の止め時を確認したり、再発の予兆をつかんだりするのにも役立てられると期待している。まだまだ検体数が少ないので、今後は対象者を増やして乳がん検出の感度と特異度を評価していきたい。患者さんの協力をいただいて100人以上の臨床研究を目指している。また、乳がん以外のがんにも対象を広げていきたい。神戸大学附属病院の先生方も関心を示してくれ、大腸がんや膀胱がん、卵巣がんなども調べていく計画だ」と竹内教授。
　TearExo法は国際的にも評価が高い。2019年1月にはドイツ化学会国際誌『Angewandte Chemie International Edition』電子版に、また2020年3月にはアメリカ化学会国際誌『Journal of the American Chemical Society』電子版に論文が掲載された。いずれも高インパクトファクターの著名な論文誌だ。研究イメージのイラスト（下）は表紙にも採用された。
竹内教授の背面に映っているのが、アメリカ化学会国際誌『Journal of the American Chemical Society』の表紙。涙のエクソソームが、光を放つセンシングチップの穴の中に引き寄せられていくイメージをイラスト化した吸着概念図が掲載された（写真：今 紀之）
　また国内では、2019年12月に開催された技術コンペ「第2回メドテックグランプリ神戸」で最優秀賞と「ロート賞」と「日本ユニシス賞」のトリプル受賞も果たしている。最優秀賞では、賞金30万円と事業投資500万円を受ける権利を獲得した。
実用化に向けたクラウドファンディングも開始
　竹内教授らの研究は、国立研究開発法人科学技術振興機構（JST）の大学発新産業創出プログラム（START）にも採択されている。このプログラムが終了する2022年度までには、TearExo法を実用化して神戸大学発ベンチャーを立ち上げる予定だ。また体外診断用医薬品として、医薬品医療機器総合機構（PMDA）にも承認審査請求をしていくという。
　「実用化に向けて、クラウドファンディングも始めることにした。現在、エクソソーム自動分析計は工学研究科にのみ設置されているが、今後は乳がんの検出を本格化させるため、神戸大学医学部附属病院内にも配置したい。そのための経費約1000万円をみなさんの協力で調達できたらと考えている。ぜひ一度、サイトをのぞいてみてください」と竹内教授は協力を呼びかける。
クラウドファンディングのURLは下記の通り。
｢涙で乳がんを検出する！研究を加速させる一歩にご支援を｣
https://readyfor.jp/projects/TearExo

　乳がんで泣かなくてもすむように、涙は早期発見のために捧げたい。実用化が待ち遠しい新技術だ。